Biotrakアッセイフローチャート

以下は代表例です。
添付プロトコールを再度確認し、手順通りにアッセイを行ってください。また、サンプル／標準は必ず二重の測定を行ってください。

分注操作
	順番通り正確な量を分注してください。 どのウェルに何を入れるか、あらかじめ図示しておくと間違いがありません。 ウェルに入れる順番を決めたら最後まで変えないでください。最初にA1 → A2 →…→ H11 → H12 としたら、以降も同じ順番で加えてください。 各段階での分注操作は20 分以内に終了してください。時間がかかると値のばらつきが大きくなります。 入れ忘れに注意！分注済みウェルを記録したり分注済みチップを並べたりし、入れ忘れのないようにしてください。 チップ先端はウェルに接触させないでください。固相抗体をかきとってしまうので、吸光度のばらつきの原因になります。 各標準／サンプルごとに、チップは交換してください。交換しないと吸光度のばらつきや信頼性低下の原因になります。
インキュベーション
	プロトコール通りの方法・温度・時間でインキュベーションします。 室温とは20 〜 25 ℃です。室内温度は場所によりまちまちです。温度が低いと吸光度が低くなり、高いと吸光度が高くなったり、ばらつきが生じます。実験室の温度分布を確認してみてください。 時間は正確に守ってください。時間が短いと吸光度が低くなり、逆に長いと吸光度が高くなりすぎることがあります。 振盪の指示があるのに振盪しないと吸光度が低くなります。
洗浄操作
	洗浄中にウェルストリップがはずれるおそれがあります。あらかじめウェルにナンバリングしておくことをおすすめします。 はじめに反応液を捨てます。 洗浄ビンで行う場合は、廃液用バット等の上でプレートに洗浄液を充分量注ぎます。 廃液用バットの上で裏返して洗浄液を捨てます。重ねたペーパータオルにプレートを裏返しに置き何回か叩いたり、プレートをタオルに叩き付け、水滴を除いてください。 プレートをペーパータオルで巻き、振り回した後叩き付けるのも良い方法です。大胆な方が良い結果になります。ただ、ウェルが破損するまでやらないでください。 プレートウォッシャー使用の場合には、十分量の洗浄液をセットし、ノズルの位置を確認してください。ウェルに接触すると固相抗体を削るので、吸光度がばらつきます。 洗浄操作後は、洗浄ビンの場合と同じく、残った水滴をよく除いてください。 洗浄が不十分だと、結果がばらついたり、NSB が高くなります。この操作を指定回数繰り返してください。 チメロサールを含む場合は、反応液および洗浄廃液を有機水銀化合物の廃液容器に集めてください。廃棄方法に関しては所属する施設の指示に従ってください。
分注操作
	前に述べた分注操作の注意点を再度確認してください。同一試薬の分注にはマルチチャンネルピペットや連続分注器の使用をおすすめします。
インキュベーション
	前述のインキュベーションの注意点を再度確認してください。
洗浄操作
	上述の洗浄操作の注意点を再度確認してください。
基質添加
	調製済み基質は、着色していないことを確認してください。 分割使用の場合、直接ピペットで分注するのは不純物の混入などにより変質の原因になります。チューブ等に適量取り分けて分注してください。 基質を加えるとすぐに測定物質濃度に応じ着色してきます。ELISA は高濃度標準の、EIA はゼロ標準のウェルが発色してくることを確認してください。 （TMB では濃い青に見えます。写真参照） 時間は正確に。キットによりインキュベーション条件（暗所で・振盪・カバーをするなど）が違います。添付プロトコールを確認してください。 吸光度の最大値が3 以上のキットもあります。用いるマイクロプレートリーダーでこの測定ができない場合、基質反応時間の短縮で調整します。
反応停止
	停止液は強酸です。取扱いに注意してください。 停止液を加えるとすぐに変色します。（TMB は黄色になります。写真参照） 標準曲線用ウェルの列の濃度が、段階的に着色しているのが確認できるはずです。 加えたらすぐにマイクロプレートリーダーにセットして、吸光度を測定してください。
吸光度測定
	プレート底部の汚れは、ペーパータオルなどで拭き取ってください。 測定は速やかに（反応停止後30 分以内に）行ってください。放置するとウェルによっては退色し、結果がばらつきます。 TMB は450 nm、OPD は492 nm で測定します。 ELISA は両対数目盛で、横軸に濃度、縦軸に吸光度をとると右上がりの標準曲線になります。 EIA は片対数目盛で、横軸に濃度、縦軸に吸光度をとると右下がりの標準曲線になります。通常ゼロ標準の吸光度を100 % とし、各濃度の吸光度を% 表示（B ／ B0 %）してグラフにします。 得られた吸光度を精度良く濃度に換算できるグラフを作成することが重要です。解析ソフトウェアはプレートリーダーに付属していることが多いので、その中から適当なものを選んでください。 グラフを手書きして濃度を読みとることも可能です。 ELISAの標準曲線　　　　　　　　　　　　EIAの標準曲線